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Amplificazione riproducibile del DNA in PCR

20.10.2017

Punti chiave da considerare per avere un sistema robusto e risolvere eventuali debolezze

L’amplificazione del DNA in vitro tramite la tecnica della PCR (Polymerase Chain Reaction) sviluppata nel 1983 da Kary Mullins è diventata nel corso del tempo uno dei metodi di base più importanti nei laboratori delle Bioscienze. Oggigiorno la maggior parte delle PCR di base sono robuste e semplici da eseguire ma è importante ricordare alcuni punti chiave fondamentali che possono aiutare per avere un sistema robusto e risolvere eventuali punti deboli.

1.   Misurare la concentrazione del DNA
Determinare con uno spettrofotometro UV-Vis a cuvetta o a goccia la concentrazione e la purezza de DNA. La purezza ideale rispetto alla presenza di Proteine (Rapporto A260/ A280 = 1,7-2,0) e rispetto ai Carboidrati, Sali e solventi organici (Rapporto A260/ A230 > 2,0).

Si ricorda che nella lettura della concentrazione degli Acidi Nucleici la verifica del corretto valore dell’Assorbanza è importante. L’Assorbanza per letture affidabili della concentrazione deve essere compresa tra 0,1-1,0 in accordo con la legge di Lambert-Beer. Eventualmente procedere con diluizioni del campione o per concentrazioni troppo basse e campioni particolarmente contaminati procedere con letture in fluorescenza.

2.   Preparazione della MasterMIX
Preparare la MasterMix in una sola provetta per prevenire errori di pipettaggio quando si parte da MasterMix multiple. Utilizzare una provetta di volume sufficiente (ad esempio: provette da 5ml) per contenere l’intera MasterMix.

Aliquotare la MasterMix subito dopo la preparazione per evitare scongelamenti multipli che possono avere un impatto negativo sulla riproducibilità della reazione di PCR.

3.   In caso di amplificazione non-specifica
Utilizzare protocolli di PCR con enzimi Taq DNA Polimerasi HotStart. Verificare che il Termociclatore sia correttamente calibrato e raggiunga rapidamente la temperatura richiesta dal programma. Per nuove coppie di primer eseguire una seduta a primer singoli (forward o reverse). Eseguire una titolazione degli ioni Mg2+ per ottimizzarene la concentrazione nella specifica PCR.

4.   In caso di assente o scarsa amplificazione
Ottimizzare la temperatura di denaturazione e/o annealing con il Gradiente. Eventualmente utilizzare PCR enhancer (ad esempio: DMSO, BSA, altro…) poiché ogni singola reazione richiede un test sperimentale per specifiche combinazioni di templato e coppie di primer.

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