Protocole d’ensemencement cellulaire – guide pour réussir l’ensemencement

Cet article a été publié à l’origine dans « Inside Cell Culture » , la newsletter mensuelle destinée aux professionnels de la culture cellulaire. Pour plus d’articles intéressants sur les incubateurs à CO₂ : consultez notre page « FAQ et ressources sur les incubateurs à CO₂ » .

Dr. Jessica Wagener, spécialiste des applications de manipulation cellulaire chez Eppendorf

Sommaire

• L’impact des protocoles d’ensemencement cellulaire standardisés
• Le facteur temps et la sédimentation des cellules
• Vidéo : Une technique de pipetage appropriée
• Formation de bulles d’air
• Vidéo : Éviter la formation de bulles d’air au cours de l’ensemencement cellulaire
• Adhésion homogène des cellules
• Comportement lié à la densité cellulaire

Pourquoi l’ensemencement des cellules constitue-t-il une étape cruciale dans toute expérience de culture cellulaire ?

L’ensemencement cellulaire est généralement l’étape initiale d’un protocole et une procédure standard pour les expériences impliquant des cellules. Un protocole correct et standardisé est un facteur essentiel pour obtenir des résultats reproductibles. La principale difficulté réside dans l’obtention d’un nombre comparable de cellules à chaque itération de l’expérience. Les variations du nombre de cellules ensemencées, ainsi que la formation de bulles d’air lors de l’ensemencement, augmentent la déviation standard et réduisent la fiabilité des résultats. C’est pourquoi vous devez prendre en compte plusieurs facteurs pour établir un protocole adapté au sein de votre laboratoire.

Le facteur temps dans les protocoles d’ensemencement cellulaire

Lors de l’ensemencement des cellules, par exemple depuis un tube de 15 mL vers une plaque multi-puits, le remplissage complet de tous les puits nécessite un certain temps. Peu importe si vous utiliser ici une pipette monocanal ou multicanaux, plus le processus est long, plus vos cellules vont se sédimenter dans le tube. Par conséquent, vous n’obtiendrez pas le même nombre de cellules d’un puits à l’autre si vous n’agitez pas la suspension cellulaire dans le tube ou le réservoir (cf. image 1).

Le processus de sédimentation des cellules est assez rapide (quelques minutes). Afin de prévenir cet effet, vous devez agiter ou remettre les cellules en suspension avant de les ensemencer pour assurer l’homogénéité de la solution. Ainsi, vous avez le même nombre de cellules par puits.

Vidéo : Une technique de pipetage appropriée dans un protocole d’ensemencement cellulaire

Formation de bulles d’air au cours de l’ensemencement

De la mousse a tendance à se former dans le milieu de la culture cellulaire en raison de la teneur élevée en protéine du sérum ajouté. Les bulles d’air empêchent l’attachement des cellules au cours de l’ensemencement, ce qui provoque des variations du nombre de cellules entre les puits (cf. image 2). Elles peuvent avoir un impact important, en particulier pour les petits formats de plaques (par ex. 96 et 384 puits), en raison de la faible surface de croissance par puits. Même si la remise en suspension ou l’agitation est nécessaire, faites attention à ne pas trop pipeter afin de minimiser la formation de bulles d’air. Un pipetage doux permet également de limiter l’exposition de vos cellules à des forces et au stress de cisaillement, un aspect essentiel de tout protocole d’ensemencement cellulaire.

Vidéo : Éviter la formation de bulles d’air au cours de l’ensemencement cellulaire

Adhésion homogène des cellules

Au-delà du nombre total de cellules, une répartition homogène sur la surface de croissance d’un récipient de culture peut influencer le résultat de l’expérience. Plusieurs techniques sont couramment utilisées et sont généralement transmises par les chercheurs expérimentés à leurs apprentis. Mais quelle est la meilleure méthode pour répartir de manière homogène les cellules sur la surface de croissance ? Différentes techniques sont comparées sur l’image 3.

À gauche, on observe ce qui se produit lorsque le récipient est simplement pré-rempli avec le milieu de culture avant l’ajout des cellules. Le résultat ? Les cellules adhèrent principalement au centre du récipient. Pour assurer une répartition homogène des cellules, certains procèdent en faisant un 8 alors que d’autres préfèrent un motif en croix sur la plaque ou la boîte. Ces deux techniques enregistrent une meilleure répartition des cellules que la première. Toutefois, plus le diamètre du récipient est petit, moins le liquide est mis en mouvement ce qui provoque une répartition inégale des cellules. Pour éviter cet effet lors de l’ensemencement, une méthode efficace consiste d’abord à diluer la suspension cellulaire dans un tube ou réservoir afin d’obtenir la concentration souhaitée (mastermix), puis à transférer le volume final dans le récipient de culture par pipetage.

Quelle est l’importance de la densité cellulaire ?

L’homogénéité dans la répartition des cellules peut influencer de manière significative vos résultats expérimentaux. Bien entendu, tous les types de cellules ont tendance à croître en formant des colonies plutôt qu’une couche monomoléculaire homogène. Mais, en général, les cellules devraient se répartir sur toute la surface du récipient de culture de manière aussi homogène que possible. Un exemple de l’influence directe de la distribution et des réponses cellulaires est l’efficacité de la transfection (cf. images 4 et 5).

Comme le montre le graphique, le taux maximal de cellules transfectées par rapport aux cellules non transfectées est obtenu à une densité cellulaire intermédiaire. De plus, une transfection efficace et homogène résulte d’une couche cellulaire uniformément répartie, obtenue grâce à la technique du mastermix. L’intégration de ces deux facteurs dans un protocole d’ensemencement cellulaire optimisera votre efficacité de transfection et réduira la déviation standard.