细胞接种方案——正确接种细胞指南

实验室学院

细胞接种通常是细胞类实验的第一步，也是标准程序之一。正确、规范的细胞接种操作是确保实验结果可复现的关键因素。其核心挑战在于如何实现并维持所有重复实验中的细胞数量相差无几。

本文首次发表于 “Inside Cell Culture” ，一本面向细胞培养专业人士的月刊。有关CO₂培养箱的更多文章，请查看网页 “CO₂培养箱常见问题与相关资料”。。

Jessica Wagener博士，Eppendorf细胞处理应用专家

细胞接种通常是细胞类实验的第一步，也是标准程序之一。正确、规范的细胞接种操作是确保实验结果可复现的关键因素。其核心挑战在于如何实现并维持所有重复实验中的细胞数量相差无几。接种细胞数量差异以及接种过程中气泡产生会导致标准差增大，从而降低实验结果的可靠性。因此，要制定出可靠的细胞接种方案，实验室需要综合考虑多个因素。

细胞接种方案中的时间因素

将细胞从15 mL试管接种至多孔板，需要花费一定时间才能接种完所有孔井。无论接种方案是规定使用单道还是多道移液器，操作过程耗时越长，试管内沉降的细胞就越多。若不搅拌试管或储液槽内的细胞悬液，则不同孔井间的细胞数量将存在差异（图1）。

图1：细胞沉降是制定每份细胞接种方案都必须考虑的关键因素。管内细胞会在数分钟内沉降，细胞接种过程耗时越长，上清液中细胞数量就越少。

细胞沉降过程相当迅速，会在数分钟内发生。为避免细胞沉降带来的不利影响，需要在接种前重悬或混合细胞，并通过搅动形成均匀悬液。这种方式可以确保每个孔井内的细胞数量相等。

视频：细胞接种实验中的正确移液技巧

细胞接种过程中气泡产生

细胞培养基因添加血清而导致蛋白质含量较高，因此容易产生泡沫。气泡会阻碍细胞在接种过程中附着，造成孔井间细胞数量不一致（图2）。尤其是在96孔或384孔等小型孔板中，由于孔井内生长空间有限，气泡对细胞的影响更为明显。因此，虽然重悬或搅拌确有必要，但应避免过度操作，以减少移液次数和气泡生成。同时，作为每次细胞接种操作的关键环节，轻柔移液也能减小细胞所受到的剪切应力和压力。

接种后贴壁细胞显微图像。图像中央靠近气泡的细胞仍呈圆形，说明细胞未能附着至生长表面。

图2：细胞接种过程中产生的气泡会阻碍细胞附着。注意气泡周围的细胞无法正常附着于容器底部。

视频：如何避免细胞接种过程产生气泡

均匀细胞粘附

除数量相等外，细胞能否均匀分布于培养容器生长表面也会影响实验结果。接种技术通常由实验室中经验更为丰富的科研人员口传身授，因此普遍存在不同。要使细胞均匀分布于生长表面，理想方法是什么？图3展示了不同接种技术的对比结果。

左侧采用的方法是先往容器中预注培养基再加注细胞。其结果便是细胞主要聚集于容器中央。为实现细胞均匀分布，有人会采用“8字”搅拌法，有人则更偏好“十字”分格法。两种方法都有助于改善细胞分布。然而，容器直径越小，悬液流动越差，细胞分布也就越不均匀。规避此问题的有效方法是：先在试管或储液槽内将细胞悬液稀释至目标浓度（预混液），再一次性将最终体积移取至培养容器。

四个细胞培养皿分别采用不同移液技术接种，经固定和染色后可以看出，所用细胞接种技术不同，培养皿内细胞密度也各不相同。

图3：不同接种技术的效果各异，但目的都是确保细胞转移至培养容器中后能均匀附着。推荐使用细胞浓度满足要求的预混液。采用结晶紫溶液固定和染色细胞。

细胞密度重要吗？

细胞均匀分布会对实验结果产生重大影响。当然，某些细胞更倾向于以菌落形式生长，而非形成均匀的单细胞层。但总体而言，细胞应尽可能均匀地分布于培养容器的整个生长表面。细胞分布与细胞应答之间存在直接关联，证据之一便是转染效率（图4和图5）。

图4：采用两种细胞接种方式后，细胞培养皿中不同区域GFP转染细胞的分布情况。

如图所示，中等细胞密度下转染细胞与未转染细胞的比例最高。此外，采用预混液方法可以形成均匀分布的细胞层，从而获得一致的转染效率。在细胞接种方案中同时考虑这两大因素能够优化转染效率、缩小标准差。

下图显示了采用两种不同移液技术进行细胞接种时，培养容器内不同区域转染细胞与未转染细胞之比。

图5：转染效率与细胞密度相关。中等细胞密度结合预混液法能够显著提高转染率和细胞分布均匀度。

细胞接种方案——正确接种细胞指南

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