Frascos para agitação: para além dos volumes de enchimento

Os biorreatores agitados, também chamados de Erlenmeyers ou simplesmente frascos para agitação, foram introduzidos nos laboratórios no início do século passado. Com uma capacidade de 25 mL a 5 litros, eles oferecem flexibilidade para uma enorme variedade de aplicações experimentais, do rastreio e da expansão até a concepção de meios e desenvolvimento do processo inicial. Eles têm um preço econômico e se adequam ao cultivo de bactérias, leveduras e fungos, bem como de células de plantas e animais em suspensão. Embora não seja necessário um treinamento específico para trabalhar com frascos para agitação, devemos considerar alguns aspectos para um cultivo eficiente e entender que há diferentes tipos de recipiente para diferentes tipos de aplicações.

Material do frasco: vidro ou plástico
Os frascos estão disponíveis em vidro ou plástico. Para aplicações de microbiologia clássicas, os Erlenmeyers de vidro autoclaváveis são o instrumento mais adequado em praticamente todos os casos. Além disso, se a transferência de oxigênio for um fator crítico, poderá ser vantajoso trabalhar com vidro, uma vez que o vidro é um material hidrófilo que promove a formação da película de líquido responsável pela transferência de oxigênio. Em comparação, o plástico, se não receber tratamento específico, é hidrofóbico [1]. Quando o mais importante é a contaminação, por exemplo, na manipulação de culturas ou em etapas de produção sensíveis, os frascos estéreis descartáveis de uno único com tampas de filtragem ventiladas de 0,2 µm proporcionam conforto e segurança máximas. O mercado oferece diferentes materiais plásticos, em função da aplicação e das suas preferências pessoais. Desde polipropileno (PP) altamente resistente para aplicações de microbiologia até materiais transparentes com enfoque em aplicações de cultura de células de mamíferos, tais como policarbonato (PC) ou polietileno tereftalato glicol (PETG).

Design de frascos: formas e defletores especiais
O objetivo de agitar culturas é aumentar a aeração e a disponibilidade de nutrientes e evitar a sedimentação. Os frascos Erlenmeyer típicos apresentam um corpo cônico com uma base mais larga e um gargalo cilíndrico. Existe uma grande variedade de designs de frasco diferentes, com gargalos largos ou estreitos, com ou sem defletores. Os designs especiais estão disponíveis para melhorar ainda mais a troca de gases, como o frasco Fernbach com grande volume e uma base mais larga e que oferece, com isso, uma área maior para a transferência de oxigênio, ou os frascos descartáveis Ultra Yield™ e Optimum Growth™ com uma forma otimizada para maximizar a relação superfície/volume [2].
Com ou sem defletores: Nos frascos sem defletores é gerado um fluxo regular e uniforme de líquido agitado, com uma geometria previsível e bem definida [2]. Em comparação, nos frascos com defletores essa agitação é perturbada propositadamente com cavidades definidas implementadas no fundo. Esse design que ‘quebra a agitação’ melhora a aeração da cultura e pode ser vantajoso quando as demandas de oxigênio da cultura são elevadas. Com base em uma aeração melhorada, os frascos com defletores também podem ser úteis na manipulação de culturas viscosas, como, por exemplo, fungos filamentosos, para prevenir a agregação de esporos ou a formação de pellets na respectiva cultura [3]. Em contrapartida, há um risco maior de formação de espuma que pode prejudicar a transferência de oxigênio. Além disso, os resultados dos frascos com defletores podem ser mais variáveis do que os resultados de frascos sem defletores devido à interrupção abrupta da rotação e a um comportamento mais caótico do fluxo [2].

https://handling-solutions.eppendorf.com/cell-handling/bioprocess/processes-and-applications/detailview/news/its-not-just-about-size-talking-about-shake-flasks-and-bioreactors/​​​​​​​

Tampas de frasco: das tampas tradicionais em algodão às tampas ventiladas.
Para evitar a contaminação das culturas, estão disponíveis diferentes tampas para estes frascos. A tampa deve evitar contaminação ao mesmo tempo que facilita suficientemente a aeração das culturas. As tampas existentes no mercado variam dos tampões tradicionais, passando por tampas metálicas ou esponjas de silicone, até tampas de filtragem de uso único. A relação de transferência de oxigênio através da tampa depende do coeficiente de difusão do oxigênio no material, da largura da abertura do gargalo e da profundidade do bujão [1]. Se a contaminação for um aspecto relevante, deve se evitar usar tampões de algodão, uma vez que os derramamentos (por exemplo, ao usar frascos com defletores) ou o vapor de condensação pode umedecer o algodão e causar contaminação cruzada. No geral, deve-se evitar molhar a tampa do frasco não só para reduzir a contaminação cruzada, mas também para não reduzir a permeabilidade a gases. Isso também se aplica a materiais de filtragem não hidrofóbicos, que também podem absorver o líquido. Para não haver diferenças entre os índices de transferência de gases, deve se usar o mesmo tipo de tampa em experimentos paralelos.

Quais volumes de enchimento são recomendados?
Quanto mais a cultura necessitar de aeração, menor deverá ser o volume de enchimento escolhido. Regra geral: no caso de culturas microbianas, não se deve exceder um enchimento de 1/5 da capacidade nominal do frasco, por exemplo, 100 mL para um frasco Erlenmeyer de 500 mL. Se for necessário realizar uma transferência máxima de oxigênio, por exemplo, para fermentações longas de estirpes com alto consumo de oxigênio, o volume de enchimento deve ser reduzido até um mínimo de 10% com a velocidade de rotação aumentada até o máximo permitido pela resistência a estresse de cisalhamento da cultura. Para culturas com células de mamíferos sensíveis a cisalhamento, é comum usar volumes de enchimento superiores entre 30 a 40% aplicando velocidades de agitação ≤ 150 rpm. Nos últimos anos, os frascos específicos para obter uma expressão proteica ou plasmídea de alto rendimento evoluíram consideravelmente, tais como os frascos Ultra Yield™ e Optimum Growth™ mencionados antes, ambos com uma proporção superfície/volume otimizada e defletores de fundo para uma melhor transferência de oxigênio com volume de enchimento superior [2].

Referências:
[1] Pauline M. Doran, Bioprocess Engineering Principles (segunda edição), Capítulo 10 - Mass Transfer, 2013
[2] htslabs.com
[3] J. Büchs/Biochemical Engineering Journal 7 (2001) 91–98
[4] Filamentous Fungal Cultures – Process Characteristics, Products, and Applications Hesham A. El-Enshasy, in Bioprocessing for Value-Added Products from Renewable Resources, 2007