Protocolo de semeadura de células – Guia para semear suas células corretamente

Este artigo foi publicado originalmente em "Inside Cell Culture" , a newsletter mensal para profissionais d . Descubra mais artigos interessantes sobre incubadoras de CO₂ em nossa página "Perguntas frequentes e materiais sobre incubadoras de CO₂" .

Jessica Wagener, Application Specialist Cell Handling na Eppendorf

Índice

• O impacto de um protocolo de semeadura de células
• O fator tempo e a sedimentação de células
• Vídeo: Técnica de pipetagem correta
• Formação de bolhas de ar
• Vídeo:Como evitar a formação de bolhas de ar na semeadura de células
• Aderência homogênea de células
• Comportamento dependente da densidade celular

Porque a semeadura de células é uma fase crítica em todos os experimentos de ?

Geralmente, a semeadura de células é a primeira fase d protocolo e é um procedimento padrão em experimentos de base celular.Um protocolo de semeadura de células correto e é um fator crítico para resultados experimentais reprodutíveis.O desafio principal nesta fase é obter e manter números de células comparáveis em todos os experimentos repetidos.Variações nos números de células e a formação de bolhas de ar durante a semeadura aumentarão os desvios padrão, tornando seus resultados menos confiáveis. Por isso, é necessário considerar vários fatores ao estabelecer um protocolo de semeadura de células consistente em seu laboratório.

O fator tempo em protocolos de semeadura de células

Quando semeia suas células, de um tubo de 15 mL para uma placa multipoços, por exemplo, você demora algum tempo até encher todos os poços. Independentemente de usar uma pipeta monocanal ou multicanal em seu protocolo de semeadura de células, quanto mais longo for o processo, mais as células sedimentar no tubo. Assim, sem agitar a suspensão celular no recipiente ou no reservatório, você obterá números de células variáveis de um poço para outro (Imagem 1).

O processo de sedimentação celular é bastante rápido, bastando alguns minutos. Para evitar esse efeito, você precisa ressuspender ou misturar as células antes da semeadura para agitá-las e formar uma solução homogênea. , você garante um número de células igual em cada poço.

Vídeo:Técnica de pipetagem correta em um protocolo de semeadura de células

Formação de bolhas de ar durante a semeadura de células

Os meios de tendem a formar espuma devido ao alto teor de proteína do soro suplementado. As bolhas de ar podem impedir a aderência das células durante a semeadura, gerando variações no número de células de poço para poço (Imagem 2). Especialmente em formatos de placa menores, como em placas de 96 e 384 poços, as bolhas de ar podem ter um grande impacto devido à menor área de crescimento por poço. Portanto, apesar de ser necessário ressuspender ou misturar, não devemos exagerar e devemos evitar pipetar em excesso para reduzir a formação de bolhas de ar. pipetagem suave também reduz as forças de cisalhamento e o estresse células, uma crítica de todos os protocolos de semeadura de células.

Vídeo:Como evitar a formação de bolhas de ar na semeadura de células

Aderência homogênea de células

lém de um número de células igual, uma distribuição homogênea de células na superfície de crescimento de um recipiente de pode impactar seu resultado experimental. Diferentes técnicas são comuns, muitas vezes passadas de cientistas com mais experiência em um laboratório para seus estagiários. Mas qual é o melhor método para distribuir uniformemente as células na superfície de crescimento? Na Imagem 3, apresentamos uma comparação de diferentes técnicas.

esquerda, pode ver o que acontece o recipiente com meio de cultura celular, adiciona as células e . resultado as células aderem essencialmente ao centro do recipiente. Para obter uma distribuição das células, algumas pessoas fazem um movimento de "oito", enquanto outras preferem um movimento em cruz da placa ou . Ambas as técnicas resultam em uma melhor distribuição das células. Porém, quanto menor o diâmetro do recipiente, meno movimento do líquido, causando uma distribuição d células. Um modo eficaz de evitar esse efeito durante a semeadura de células é diluir primeiro a suspensão celular na concentração desejada em um tubo ou reservatório () e, , pipetar o volume final no recipiente de de uma vez só.

A densidade celular é importante?

A uniformidade da distribuição de células pode ter um impacto significativo em seu experimento. Obviamente, há tipos de células que tendem a crescer em colônias ao invés de formar uma camada única homogênea. Todavia, no geral, as células deverão se espalhar o mais uniformemente possível por toda a superfície de crescimento do recipiente de cult. Um exemplo que demonstra o impacto direto da distribuição de células e das reações celulares é a eficiência de transfecção (mage 4 e 5).

Conforme indicado no gráfico, a ção mais alta de células transfectadas células não transfectadas é obtida com densidade celular média. Adicionalmente, a eficiência de transfecção uniforme é o resultado de uma camada de células uniformemente distribuídas aplicando a abordagem d . Considerar ambos os fatores em um protocolo de semeadura de células irá otimizar sua eficiência de transfecção e reduzir o desvio padrão.