Protokół posiewu komórek – jak wysiewać komórki w prawidłowy sposób

Ten artykuł został pierwotnie opublikowany w „Inside Cell Culture” , comiesięcznym newsletterze dla profesjonalistów zajmujących się hodowlą komórek. Więcej ciekawych artykułów na temat inkubatorów CO₂ znajdziesz na naszej stronie „Najczęściej zadawane pytania i materiały na temat inkubatorów CO₂” .

Dr Jessica Wagener, specjalista ds. aplikacji w w zakresie hodowli komórek w Eppendorf

Spis treści

• Wpływ znormalizowanego protokołu posiewu komórek
• Czynnik czasowy i sedymentacja komórek
• Film: Prawidłowa technika pipetowania
• Tworzenie się pęcherzyków powietrza
• Film: Jak uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas posiewu komórek?
• Jednorodna adhezja komórek
• Zachowanie zależne od gęstości komórek

Dlaczego posiew komórek jest kluczowym etapem we wszystkich eksperymentach związanych z hodowlą komórek?

Posiew komórek jest zwykle pierwszym krokiem protokołu i standardową procedurą w eksperymentach opartych na komórkach. Prawidłowy, znormalizowany protokół posiewu komórek jest kluczowym warunkiem powtarzalnych wyników doświadczeń. Największym wyzwaniem na tym etapie jest osiągnięcie i utrzymanie porównywalnej liczby komórek we wszystkich powtarzanych eksperymentach. Różnice w liczbie wysiewanych komórek i tworzenie się pęcherzyków powietrza podczas wysiewu zwiększą odchylenia standardowe i powodują, że wyniki są mniej wiarygodne. Dlatego już podczas opracowywania protokołu posiewu komórek w laboratorium należy wziąć pod uwagę szereg czynników.

Czynnik czasowy w protokołach posiewu komórek

Przy wysiewaniu komórek na przykład z probówki o pojemności 15 mL do płytki wielodołkowej napełnienie wszystkich dołków zajmuje trochę czasu. Nie ma znaczenia, czy protokół przewiduje użycie pipety jednokanałowej czy wielokanałowej: im dłużej trwa ten proces, tym więcej komórek osadza się w probówce. Dlatego bez mieszania zawiesiny komórek w probówce lub zbiorniku w poszczególnych dołkach znajdzie się różna liczba komórek (rysunek 1).

Proces sedymentacji komórek przebiega dość szybko, bo trwa tylko kilka minut. Aby uniknąć tego efektu, należy ponownie utworzyć zawiesinę lub wymieszać komórki przed posianiem, aby utworzyć jednorodny roztwór. W ten sposób zapewniona będzie taka sama liczba komórek w każdym dołku.

Film: Prawidłowa technika pipetowania w protokole posiewu komórek

Tworzenie się pęcherzyków powietrza podczas wysiewu komórek

Pożywki do hodowli komórek mają tendencję do pienienia się ze względu na wysoką zawartość białka we wzbogaconej surowicy. Pęcherzyki powietrza mogą utrudniać adhezję komórek podczas posiewu, a tym samym prowadzić do różnych liczb komórek w poszczególnych dołkach (obraz 2). Szczególnie w przypadku mniejszych formatów płytek, takich jak 96- i 384-dołkowe, pęcherzyki powietrza mogą mieć duże oddziaływanie ze względu na niewielką powierzchnię wzrostu w każdym dołku. Dlatego mimo że ponowne tworzenie zawiesiny lub mieszanie jest konieczne, nie należy z nim przesadzać. Jednocześnie trzeba unikać zbyt częstego pipetowania, aby ograniczyć tworzenie się pęcherzyków powietrza. Delikatne pipetowanie zmniejsza również siły ścinające i obciążenie komórek, co jest krytycznym elementem każdego protokołu posiewu.

Film: Jak uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas posiewu komórek?

Jednorodna adhezja komórek

Oprócz takiej samej liczby komórek na wyniki eksperymentu może również wpływać ich jednorodny rozkład na powierzchni wzrostu w naczyniu hodowlanym. Stosuje się w tym celu różne techniki, które w laboratorium przekazywane są zwykle przez bardziej doświadczonych naukowców ich stażystom. Ale jaka jest najlepsza metoda na równomierne rozprowadzenie komórek na powierzchni wzrostu? Na obrazie 3 przedstawiono porównanie różnych technik.

Po lewej stronie widać, co się dzieje, jeśli po prostu napełnimy naczynie podłożem hodowlanym, dodamy komórki i zakończymy pracę. Komórki przylegają wtedy głównie do środka naczynia. Aby osiągnąć równomierny rozkład komórek, niektórzy stosują ruch w kształcie „ósemki”, inni zaś wolą wykonać płytką lub naczyniem ruch krzyżowy. Obie te techniki prowadzą do lepszego rozmieszczenia komórek. Jednak im mniejsza jest średnica naczynia, tym mniejszy ruch cieczy, co prowadzi do nierównomiernego rozkładu komórek. Skutecznym sposobem na uniknięcie tego efektu podczas posiewu komórek jest najpierw rozcieńczenie zawiesiny komórek do pożądanego stężenia w probówce lub zbiorniku (gotowa mieszanina, tzw. mastermix), a następnie pipetowanie ostatecznej objętości do naczynia hodowlanego w jednym kroku.

Czy gęstość komórek ma znaczenie?

Równomierność rozkładu komórek może mieć znaczący wpływ na eksperyment. Oczywiście istnieją typy komórek, które mają tendencję do wzrostu w koloniach zamiast tworzenia jednorodnej monowarstwy. Generalnie jednak komórki powinny być rozprowadzone jak najbardziej równomiernie na całej powierzchni naczynia hodowlanego. Jednym z przykładów pokazujących bezpośredni wpływ rozprowadzenia komórek i odpowiedzi komórkowych jest wydajność transfekcji (obraz 4 i 5).

Jak pokazano na wykresie, najwyższy stosunek komórek transfekowanych do nietransfekowanych osiąga się przy średniej gęstości komórek. Dodatkowo jednolita wydajność transfekcji wynika z równomiernie rozłożonej warstwy komórek powstałej przy zastosowaniu gotowej mieszaniny. Uwzględnienie obu tych czynników w protokole posiewu komórek pozwala zoptymalizować wydajność transfekcji i obniżyć odchylenie standardowe.