Beute per agitazione: molto più che semplici contenitori di riempimento

I bioreattori agitatori, noti anche come beute Erlenmeyer o semplicemente beute per agitazione, sono stati introdotti all'inizio del secolo scorso. Con una capacità che va da 25 mL a 5 litri, offrono la flessibilità necessaria per un'ampia gamma di scopi sperimentali, dallo screening e dall'espansione, fino alla progettazione dei terreni di coltura e allo sviluppo iniziale dei processi. Sono economici e adatti alla coltivazione di batteri, lieviti e funghi, nonché di cellule vegetali e animali in sospensione. Sebbene le beute per agitazione non richiedano una formazione specifica per essere utilizzate, è necessario tenere conto di alcuni aspetti per garantire una coltivazione efficiente ed esistono vari tipi di recipienti adatti ad applicazioni diverse.

Materiale delle beute: vetro o plastica
Le beute sono disponibili in vetro o in plastica. Per le applicazioni microbiologiche classiche, nella maggior parte dei casi sono adatte le beute Erlenmeyer in vetro riutilizzabili e autoclavabili. Inoltre, quando il trasferimento di ossigeno è fondamentale, può essere vantaggioso lavorare con il vetro, poiché essendo un materiale idrofilo favorisce la formazione del film liquido responsabile del trasferimento di ossigeno. Al contrario, la plastica, se non trattata in modo specifico, è idrofobica [1]. Quando è importante considerare la contaminazione, ad esempio nella manipolazione di colture sensibili o nelle fasi di produzione, le beute monouso sterili con tappi ventilati con filtro da 0,2 µm offrono la massima praticità e sicurezza. Sul mercato sono disponibili diversi materiali in plastica a seconda dell'applicazione e delle preferenze personali. Dal polipropilene (PP) altamente resistente per applicazioni microbiologiche fino a materiali visivamente trasparenti con particolare attenzione alle applicazioni di coltura di cellule di mammiferi, come il policarbonato (PC) o il polietilene tereftalato glicole (PETG).

Modelli delle beute: forme speciali e baffle
Lo scopo dell'agitazione delle colture è aumentare l'aerazione e la disponibilità di nutrienti e prevenire la sedimentazione. Le tipiche beute Erlenmeyer hanno un corpo conico con una base più ampia e un collo cilindrico. Esistono diversi modelli di beute, con collo largo o stretto, con o senza baffle. Sono disponibili modelli speciali per migliorare ulteriormente lo scambio gassoso, come la beuta Fernbach di grande volume con una base più ampia e quindi una superficie maggiore per il trasferimento di ossigeno, oppure le beute monouso Ultra Yield™ e Optimum Growth™ con forma ottimizzata per massimizzare il rapporto superficie/volume [2].
Con o senza baffle: nelle beute senza baffle si genera un flusso vorticoso di liquido uniforme e regolare con una geometria ben definita e prevedibile [2]. Al contrario, nelle beute con baffle questo vortice viene interrotto intenzionalmente grazie alla presenza di cavità definite nella zona del fondo. Questo modello che “interrompe il vortice” migliora l'aerazione della coltura e può essere utile quando il fabbisogno di ossigeno della coltura è elevato. Oltre a una migliore aerazione, le beute con baffle possono essere utili anche nella manipolazione di colture viscose, ad esempio funghi filamentosi, per impedire l'aggregazione delle spore o la pellettizzazione della coltura [3]. D'altra parte, vi è un maggiore rischio di formazione di schiuma che può ostacolare il trasferimento di ossigeno. Inoltre, le beute con baffle danno risultati notevolmente più variabili rispetto a quelle senza baffle a causa della brusca interruzione del vortice e del comportamento più caotico del flusso [2].

https://handling-solutions.eppendorf.com/cell-handling/bioprocess/processes-and-applications/detailview/news/its-not-just-about-size-talking-about-shake-flasks-and-bioreactors/​​​​​​​

Chiusure per beute: dai tradizionali tappi di cotone ai tappi ventilati.
Per prevenire la contaminazione delle colture, sono disponibili diverse chiusure per beute. La chiusura deve impedire la contaminazione, ma deve anche facilitare un'adeguata aerazione delle colture. Le chiusure vanno dai tradizionali tappi di cotone, ai tappi in metallo e in silicone, fino ai tappi filtranti monouso. Il tasso di trasferimento dell'ossigeno attraverso la chiusura dipende dal coefficiente di diffusione dell'ossigeno nel materiale, dalla larghezza dell'apertura del collo e dalla profondità del tappo [1]. Se la contaminazione è un problema, si dovrebbero evitare i tappi di cotone, poiché le fuoriuscite (ad esempio quando si utilizzano beute con baffle) o il vapore di condensa possono inumidire il cotone e causare una contaminazione crociata. In generale, è opportuno evitare di bagnare la chiusura della beuta, non solo per ridurre la contaminazione crociata, ma anche per non ridurre la permeabilità al gas. Ciò vale anche per i materiali filtranti non idrofobici, che possono assorbire l'umidità. Per esperimenti in parallelo è opportuno selezionare lo stesso tipo di chiusura, in modo da non avere differenze nei tassi di trasferimento del gas.

Quali sono i volumi di riempimento consigliati?
Maggiore è il fabbisogno di aerazione della coltura, minore dovrà essere il volume di riempimento. Come regola generale, per le colture microbiche non si dovrebbe superare un riempimento pari a 1/5 della capacità nominale della beuta, ad esempio 100 mL per una beuta Erlenmeyer da 500 mL. Se è richiesto il massimo trasferimento di ossigeno, ad esempio per lunghe fermentazioni di ceppi ad alto consumo di ossigeno, il volume di riempimento dovrebbe essere ridotto fino al 10% con un aumento della velocità di rotazione tanto quanto consentito dalla resistenza allo sforzo di taglio della coltura. Per le colture di cellule di mammiferi sensibili al taglio, sono comuni volumi di riempimento più elevati, compresi tra il 30 e il 40%, con velocità di agitazione inferiori a ≤ 150 rpm. Negli ultimi anni sono stati sviluppati tipi specifici di beute destinate all'espressione di proteine o plasmidi ad alta resa, come le già citate Ultra Yield™ e Optimum Growth™, entrambe con un rapporto superficie/volume ottimizzato e baffle sul fondo per un migliore trasferimento di ossigeno che consente un volume di riempimento più elevato [2].

Riferimenti:
[1] Pauline M. Doran, Bioprocess Engineering Principles (seconda edizione), capitolo 10 - Mass Transfer, 2013
[2] htslabs.com
[3] J. Büchs / Biochemical Engineering Journal 7 (2001) 91–98
[4] Filamentous Fungal Cultures – Process Characteristics, Products, and Applications Hesham A. El-Enshasy, in Bioprocessing for Value-Added Products from Renewable Resources, 2007