Protocollo di semina cellulare: la guida su come seminare correttamente le cellule

Questo articolo è stato pubblicato per la prima volta su “Inside Cell Culture” , la newsletter mensile dedicata ai professionisti della coltura cellulare. Altri articoli interessanti sugli incubatori a CO₂ sono disponibili sulla nostra pagina “FAQ e materiale sugli incubatori a CO₂” .

Dott.ssa Jessica Wagener, specialista delle applicazioni di manipolazione cellulare presso Eppendorf

Indice

• L'impatto di un protocollo di semina cellulare standardizzato
• Il fattore tempo e la sedimentazione cellulare
• Video: la tecnica di pipettaggio corretta
• Formazione di bolle d'aria
• Video: come evitare la formazione di bolle d'aria nella semina cellulare
• Adesione cellulare omogenea
• Comportamento dipendente dalla densità cellulare

Perché la semina cellulare è una fase fondamentale in tutti gli esperimenti di coltura cellulare?

La semina cellulare è solitamente il primo passo del protocollo e una procedura standard negli esperimenti su cellule. Un protocollo di semina cellulare corretto e standardizzato è un fattore critico per ottenere risultati sperimentali riproducibili. La sfida principale in questa fase è quella di ottenere e mantenere numeri comparabili di cellule in tutti gli esperimenti ripetuti. Le variazioni nel numero di cellule seminate e la formazione di bolle d'aria durante la semina aumenteranno le deviazioni standard, rendendo i risultati meno affidabili. Pertanto, è necessario tenere presenti diversi fattori quando si definisce un protocollo solido per la semina cellulare nel proprio laboratorio.

Il fattore tempo nei protocolli di semina cellulare

Quando si seminano le cellule, ad esempio da una provetta da 15 mL in una piastra multipozzetto, occorre un po' di tempo per riempire tutti i pozzetti. Indipendentemente dal fatto che il protocollo di semina cellulare preveda l'utilizzo di una pipetta monocanale o multicanale, più lungo sarà il processo, maggiore sarà il numero di cellule che sedimenteranno nella provetta. Pertanto, senza miscelare la sospensione cellulare nella provetta o nel recipiente, si otterrà un numero di cellule variabile da un pozzetto all'altro (Figura 1).

Il processo di sedimentazione cellulare è abbastanza rapido, avviene entro pochi minuti. Per evitare questo problema, è necessario risospendere o miscelare le cellule prima della semina per agitarle e generare una soluzione omogenea. In questo modo si garantisce un numero uguale di cellule per pozzetto.

Video: La tecnica di pipettaggio corretta in un protocollo di semina cellulare

Formazione di bolle d'aria durante la semina cellulare

I terreni di coltura cellulare tendono a formare schiuma a causa dell'elevato contenuto proteico del siero aggiunto. Le bolle d'aria possono ostacolare l'adesione delle cellule durante la semina e quindi creare variazioni nel numero di cellule da un pozzetto all'altro (Figura 2). Soprattutto nei formati di piastre più piccoli, come le piastre a 96 e 384 pozzetti, le bolle d'aria possono avere un impatto significativo a causa della ridotta area di crescita per pozzetto. Pertanto, sebbene sia necessario risospendere o miscelare, è importante non esagerare ed evitare un pipettaggio eccessivo per ridurre la formazione di bolle d'aria. Un pipettaggio delicato riduce anche le forze e lo sforzo di taglio per le cellule, un aspetto fondamentale in ogni protocollo di semina cellulare.

Video: come evitare la formazione di bolle d'aria nella semina cellulare

Adesione cellulare omogenea

Oltre a un numero uguale di cellule, anche una distribuzione omogenea delle stesse sulla superficie di crescita di un recipiente di coltura può influire sui risultati sperimentali. Esistono diverse tecniche comunemente utilizzate, solitamente tramandate dagli scienziati più esperti di un laboratorio ai propri tirocinanti. Ma qual è il metodo migliore per distribuire uniformemente le cellule sulla superficie di crescita? Nella Figura 3 è possibile vedere un confronto tra diverse tecniche.

A sinistra, si vede cosa succede se si riempie semplicemente il recipiente con il terreno di coltura cellulare, si aggiungono le cellule e ci si ferma lì. Il risultato è che le cellule aderiscono principalmente al centro del recipiente. Per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule, alcuni usano un movimento a “otto”, mentre altri preferiscono un movimento a croce della piastra o della capsula. Entrambe le tecniche portano a una migliore distribuzione delle cellule. Tuttavia, minore è il diametro del recipiente, minore è il movimento del liquido, con conseguente distribuzione non uniforme delle cellule. Un modo efficace per ovviare a questo effetto durante la semina cellulare è quello di diluire prima la sospensione cellulare alla concentrazione desiderata in una provetta o in un recipiente (mastermix) e poi pipettare il volume finale nel recipiente di coltura in un unico passaggio.

La densità cellulare è importante?

L'uniformità della distribuzione cellulare può avere un impatto significativo sull'esperimento. Naturalmente esistono tipi di cellule che tendono a crescere in colonie piuttosto che formare un monostrato omogeneo. Tuttavia, in generale, le cellule dovrebbero distribuirsi nel modo più uniforme possibile su tutta la superficie di crescita del recipiente di coltura. Un esempio che mostra l'impatto diretto della distribuzione cellulare e delle risposte cellulari è l'efficienza di trasfezione (Figura 4 e 5).

Come mostrato nel grafico, il rapporto più elevato tra cellule trasfettate e non trasfettate si ottiene con una densità cellulare media. Inoltre, un'efficienza di trasfezione uniforme risulterà da uno strato cellulare distribuito in modo omogeneo, generato con l'applicazione dell'approccio mastermix. Considerare entrambi i fattori in un protocollo di semina cellulare ottimizzerà l'efficienza di trasfezione e ridurrà la deviazione standard.