振とうフラスコ – 容量を充填するだけではありません

振とうバイオリアクターは、三角フラスコ、また簡単に振とうフラスコとも呼ばれ、前世紀初頭に導入されました。 容量は25 mL から 5 リットルまであり、スクリーニングや拡大培養から培地設計、初期過程の開発に至るまで、幅広い実験目的に柔軟に使えます。 経済的な価格で、細菌、酵母、真菌の培養に適しているほか、植物や動物の浮遊細胞培養にも適しています。 振とうフラスコの取り扱いに特別な訓練は必要ありませんが、効率的な培養のために考慮すべき点がいくつかあり、用途に応じて適した容器の種類が異なります。

フラスコの材質 – ガラス対プラスチック
フラスコにはガラス製とプラスチック製があります。 典型的な微生物学の用途では、大抵の場合、再利用可能なオートクレーブ対応のガラス製三角フラスコが適しています。 また、酸素移動が重要な場合には、ガラス製の使用が有利なことがあります。ガラスは親水性材料なので、酸素移動を担う液膜の形成を支持するからです。 対するプラスチックは、特に処理されていない限り、疎水性です [1]。 汚染が問題となる場合、例えば敏感な培養物や開発段階のものを扱う際に、最も利便性と安全性が高いのは、通気性のある 0.2 µm フィルターキャップを備えたシングルユーズの滅菌ディスポーザブルフラスコです。 市場には用途や個人の好みによって様々なプラスチック材料があります。 微生物学用途向けの耐性が高いポリプロピレン（PP）から、ポリカーボネート（PC）やポリエチレンテレフタレートグリコール（PETG）などの哺乳類細胞培養アプリケーションに焦点を当てた光学透明材料まであります。

フラスコの設計 – 特殊形状とバッフル
振とう培養の目的は、曝気性と栄養素の可用性を高め、沈殿を防ぐことです。 典型的な三角フラスコは、底面が広い円錐形の本体に円筒形の首部があります。 フラスコには、口径が広いものや狭いもの、バッフルの有無など、様々な設計が存在します。 ガス交換をさらに改善する特殊設計のフラスコもあります。例えば、底部が広く酸素移動の面積が大きい大容量のFernbachフラスコ、また表面積対体積比を最大化する最適形状の使い捨て型Ultra Yield™やOptimum Growth Flask™などです [2]。
バッフルの有無： バッフル無しフラスコでは、均一で規則的な渦流が、はっきりと予測可能な形状で生成されます [2]。 それに対し、バッフル付きフラスコでは底部に一定のくぼみがあるため、意図的にこの渦が乱されます。 この「渦を断つ」設計は培養液の曝気性を向上させるもので、培養液の酸素要求量が高い場合に有用なことがあります。 曝気性の向上に加え、バッフル付きフラスコは糸状菌など粘性のある培養物を扱う際にも有用で、胞子の凝集や培養物のペレット化を防ぎます [3]。 一方で、泡の発生リスクが高くなり、これが酸素移動を妨げる可能性もあります。 また、バッフル付きフラスコでは、渦流の急激な乱れと予測できない流れの挙動により、バッフル無しよりも結果がかなり変動しやすくなります [2]。

https://handling-solutions.eppendorf.com/cell-handling/bioprocess/processes-and-applications/detailview/news/its-not-just-about-size-talking-about-shake-flasks-and-bioreactors/​​​​​​​

フラスコのクロージャー - 伝統的な綿栓から通気性のあるキャップまで。
培養物の汚染を防ぐため、フラスコ用のさまざまなクロージャーがあります。 クロージャーは汚染を防ぐ必要がありながらも、培養物の十分な曝気を促進する必要があります。 クロージャーは、従来の栓から金属キャップやシリコーンスポンジ、さらにはシングルユーズのフィルターキャップまで多岐にわたります。 クロージャーを通過する酸素の移動速度は、材料中の酸素の拡散係数、首部の開口幅、およびストッパーの深さに依存します [1]。 汚染が懸念される場合、綿栓は避けるべきです。これは、液漏れ（例えばバッフル付きフラスコ使用時）や結露した蒸気により綿が湿り、交差汚染を引き起こす恐れがあるためです。 フラスコのクロージャーを濡らすことは、交差汚染を減らすためだけでなく、ガス透過性を低下させないためにも、一般的に避けるべきです。 非疎水性フィルター材料も、水分を吸収する可能性があるため、同じことが当てはまります。 並行実験では、ガス移動速度に差異が生じないよう、同一タイプのクロージャーを選択すべきです。

推奨される充填量は？
培養液の曝気性の必要が高いほど、少ない充填量を選びます。 経験則として、微生物培養では、フラスコの公称容量の1/5を超える充填は避けるべきです。例えば、 500 mL の三角フラスコでは、100 mL とします。 高酸素消費性菌株の長期発酵時など、最大限の酸素移動が必要な場合、充填量をわずか10％までも減らしたうえで、せん断応力に対する培養液の耐性が許す限り、回転速度を最大まで上げる必要があります。 せん断に敏感な哺乳類培養では、一般的に充填率を 30～40 % と高くし、攪拌速度も 150 rpm 以下に抑えます。 高収量タンパク質またはプラスミド発現を目的とした特定のタイプのフラスコが近年開発されており、前述のUltra Yield™ や Optimum Growth Flask™ もその例です。いずれも最適化された表面積対体積比と底部バッフルにより酸素移動効率を向上させることで、充填量を増やせるようになっています [2]。

参考文献：
[1] Pauline M. Doran, Bioprocess Engineering Principles (Second Edition), Chapter 10 - Mass Transfer, 2013
[2] htslabs.com
[3] J. Büchs / Biochemical Engineering Journal 7 (2001) 91–98
[4] Filamentous Fungal Cultures – Process Characteristics, Products, and Applications Hesham A. El-Enshasy, in Bioprocessing for Value-Added Products from Renewable Resources, 2007